使用ROSE寻找超级增强子

一、工具介绍

ROSE（RANK ORDERING OF SUPER-ENHANCERS）是麻省理工学院Richard A. Young实验室开发的一种通过bam文件及gff文件寻找enhancer及其相关基因的工具，此工具由python编写。项目主页：http://younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html

二、ROSE在服务器上的安装

ROSE依赖软件有：Python 2.7.3, R 2.15.3, 和 SAMtools 0.1.18，因此在安装ROSE前，首先确保服务器上安装了这三个工具。关于这三个工具的安装，可以查看这篇博文： RNA-seq分析服务器安装生信工具过程。

ROSE安装方式见以下代码：

wget https://bitbucket.org/young_computation/rose/get/1a9bb86b5464.zip
unzip 1a9bb86b5464.zip
# 解压后文件见下图，可以直接通过python *.py调用工具

三、具体使用

ROSE的最主要用法有ROSE_main.py和ROSE_geneMapper.py。其中ROSE_main.py 用于寻找增强子而ROSE_geneMapper.py 用于为增强子相关的基因进行注释。

• ROSE_mian.py 用法

  python ROSE_main.py -g GENOME_BUILD -i INPUT_CONSTITUENT_GFF \
  -r RANKING_BAM -o OUTPUT_DIRECTORY \
  [optional: -s STITCHING_DISTANCE -t TSS_EXCLUSION_ZONE_SIZE -c CONTROL_BAM]
  
  # 参数解释
  -g	refseq参考基因组
  -i	输入gff文件，一般为使用MACS鉴定得到的Med1富集区域（gff具体格式下文介绍）
  -r	排序后的bam文件，同时需为bam添加index
  -o	输出文件目录
  
  # 可选参数
  -s	STITCHING_DISTANCE，合并两个region的最大距离，默认值为12.5kb
  -t	TSS_EXCLUSION_ZONE_SIZE，排除TSS区域大小，排除与TSS前后某距离内的区域，以排除启动子偏差（默认值：0;推荐值：2500）。如果设置该值为0，将不会查找基因。
  -c	CONTROL_BAM，control样本的bam文件

输入文件格式要求：

bam文件格式要求：需要排序和构建index（samtools可以操作），bam文件的染色体id需要以chr开头。

gff文件格式要求：gff文件必须有以下列
1.染色体位置（chr#）
2.每个增强子区域的特定id
4.区域起始位置
5.区域终止位置
7.正负链信息（+, -, .）
gff格式参考：https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format3

ROSE也有转换bam为gff的工具，在运行ROSE_mian.py 时，会调用ROSE_bamToGFF.py 。

ROSE_main.py运行实例：

python $SOFT_PATH/ROSE_main.py -g HG38 -i $WORK_PATH/gtf/KYSE510_peaks.bed \
-r $WORK_PATH/samtools_sort/sort_treat1.bam -c $WORK_PATH/samtools_sort/sort_control1.bam \
-o $WORK_PATH/ROSE/KYSE510 -s 12500 -t 2000 2>$LOG_PATH/KYSE510_enhancer.log

其中，更多基因组可以从此处获取保存到ROSE的annotation文件夹，但是需要注意修改相应ROSE_mian.py的相应代码。

输出文件如下：
1.**OUTPUT_DIRECTORY/gff/*.gtf 该文件为输入gtf文件的副本；

2.**OUTPUT_DIRECTORY/gff/*STITCHED*.gtf 该文件为通过在STITCHING_DISTANCE将INPUT_CONSTITUENT_GFF拼接在一起创建的gff文件；文件列数如下：
chrom, name, [blank], start, end, [blank], [blank], strand, [blank], [blank], name
其中 name 字段的命名方式为：拼接起来的区域数+最左端区域ID。

3.**OUTPUT_DIRECTORY/mappedGFF/*_MAPPED.gff 每个bam文件通过bamToGFF的输出文件，包含以下列：
（成分ID，测试区域，平均读取密度（单位为每百万位元每百万映射的单位读数密度））

4.**OUTPUT_DIRECTORY/mappedGFF/* _STITCHED * _MAPPED.gff 每个bam文件通过bamToGFF的输出文件，该文件中对增强子区域进行了拼接，包含以下列：
（拼接增强子ID，测试区域，平均读取密度（单位为百万映射每单位拼接增强子数））

5.**OUTPUT_DIRECTORY/STITCHED_ENHANCER_REGION_MAP.txt bamToGFF计算后得到的拼接增强子密度文件，包含以下列：
（拼接增强子ID，染色体，拼接增强子起始位置，拼接增强子末端位置，拼接数，BAM信号等级，BAM信号）

6..**OUTPUT_DIRECTORY/*_AllEnhancers.table.txt 增强子列表，包含每个增强子的排名和是否为超级增强子，包含以下列：
（增强子ID，染色体，拼接增强子起始位点，拼接增强子末端，拼接数，拼接成分大小，BAM的信号，BAM的等级，是否为超增强子：是（1）否（0））

7.**OUTPUT_DIRECTORY/* _SuperEnhancers.table.txt 超级增强子的排名，为*_AllEnhancers.table.txt 文件的子集。包含以下列：
（拼接增强剂ID，染色体，拼接增强子起始位点，拼接增强子末端，拼接数，缝合在一起的成分的大小，RANKING_BAM的信号，RANKING_BAM的等级，超增强子的二进制（1）与典型（0））

8.**OUTPUT_DIRECTORY/*_Enhancers_withSuper.bed 可以加载到UCSC浏览器中可视化的增强子bed文件

9.**OUTPUT_DIRECTORY/*_Plot_points.png 所有增强子散点图，如下图：

• ROSE_geneMapper.py 用法

  Usage: ROSE_geneMapper.py [options] -g [GENOME] -i [INPUT_ENHANCER_FILE]
  
  # 参数解释
  -i INPUT	输入ROSE_mian.py生成的enhancer table文件
  -g GENOME	输入genome信息（MM9,MM8,HG18,HG19等）  
  -o OUT		输出路径
  # 可选参数
  -l GENELIST	要过滤的基因列表
  -w WINDOW	搜索基因距离，默认值为50,000bp
  -f format	如果使用此参数，将保持原输入文件格式输出

ROSE_geneMapper.py 运行实例：

python $SOFT_PATH/ROSE_geneMapper.py -i $WORK_PATH/ROSE/TE7/TE7_peaks_AllEnhancers.table.txt \
-g HG38 -o $WORK_PATH/ROSE/TE7 2>$LOG_PATH/TE7_enhancer_anno.log

输出文件如下：
1.**OUTPUT_DIRECTORY/*ENHANCER_TO_GENE.txt enhancer重叠基因、附近基因以及最近的基因列表

2.**OUTPUT_DIRECTORY/*GENE_TO_ENHANCER.txt 以每个基因为列名的和其相关的增强子位置信息列表

得到这两个表格即可对基因进行筛选然后进行GO及KEGG分析等。

下图是运行两工具的结果截图：

其中被红框标注的部分是ROSE_geneMapper.py 运行的结果。